茶葉多酚氧化酶同工酶熱穩定性分析

發布時間:2019-09-02 來源: 美文摘抄 點擊:

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  摘要:對分離純化得到的龍井43多酚氧化酶同工酶在30~50 ℃下的熱穩定性進行了分析,發現多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃時的熱穩定性最高,隨溫度的升高其熱穩定性下降;多酚氧化酶粗酶的熱穩定在40 ℃時最高,并整體高于多酚氧化酶同工酶的熱穩定性。試驗結果給茶葉生產中維持適當的溫度來控制多酚氧化酶的活性提供了依據。
  關鍵詞:茶葉;多酚氧化酶;同工酶;酶活力;熱穩定性
  中圖分類號:S571.1 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2017)01-0095-04
  DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.024
  Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensis
  CHEN Sheng-hu, XU Xiao-yun, WU Meng-yao, HUANG Ying-jie, YAO Yan-ni, HUANG You-yi
  (Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
  Abstract:The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30~50 ℃,the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃,and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃, and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.
  Key words:Camellia sinensis; polyphenol oxidase; isozyme; enzyme activity; thermal stability
  多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO, EC 1.10.3.1)在茶葉生理代謝及產品加工中具有重要作用。目前對茶葉PPO粗酶[1-3]研究較多,對其同工酶[4-6]也有一些報道,但整體而言對茶葉PPO同工酶的研究相對匱乏[7,8]。除在綠茶[9]中需要快速鈍化PPO外,紅茶加工[10,11]以及固定化酶體外制備茶黃素[12-14]等過程中都需要PPO具有很好的催化活性和熱穩定性。已證實茶葉PPO單一同工酶較粗酶有更高的催化效率[5,7],并且茶葉PPO基因克隆和外源表達等方面的研究進展[15,16]也使得催化活性高、熱穩定性佳的單一同工酶的工業化利用成為可能。本研究在成功分離純化得到PPO同工酶的基礎上,分析了PPO同工酶的熱穩定性,豐富了對茶葉PPO同工酶的研究,可為生產中控制茶葉PPO的活性提供參考。
  1 材料與方法
  1.1 材料
  龍井43號(Camellia sinensis var. Longjing 43)一芽二葉鮮葉于2015年春采自華中農業大學茶學專業教學基地。
  試驗儀器:DEAE Sepharose CL-6B(GE Health Bio-Sciences AB公司); Sephadex G-150(美國PHARMACIA公司);HH-2型恒溫水浴鍋(江蘇金壇中大儀器廠);Synergy HT酶標儀(基因有限公司)。所用試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。
  1.2 方法
  1.2.1 PPO同工酶分離純化 按許雷等[7,17,18]PPO同工酶分離純化方法進行分離純化。取適量茶鮮葉,加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮,5%,W/V)和0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(料液比1∶2),冰浴研磨,4 ℃下浸提12 h,離心、過濾制得粗酶液。對粗酶液進行30%~80%的硫酸銨沉淀,將所得沉淀用適量0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液溶解后,再用4倍體積同樣的緩沖液脫鹽,制得上樣液。將上樣液用DEAE-Sepharose CL-6B材料進行陰離子交換層析,選用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液各2倍柱體積進行梯度洗脫,280 nm下檢測吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。再將收集峰用Sephadex G-150材料進行凝膠過濾層析,選用含有0.10 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液等梯度洗脫,280 nm下檢測吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。重復上述過程,收集足量樣品,4 ℃保存備用。

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